RÉSUMÉ

La Revue Francophone d’Hémostase et Thrombose vous propose, outre la réception trimestrielle de la revue, des publications online régulières sur la plateforme www.rfht.fr sous la forme : • d’une veille bibliographique avec les meilleurs articles publiés dans nos spécialités ; • d’actualités commentées offrant une vision critique d’une sélection d’articles internationaux et leur mise en perspective en pratique clinique. Vous trouverez ci-après une sélection de ces articles récents, décryptés, analysés et commentés pour vous par Victor-Emmanuel Brett, Alexandre Butelet, Selma Kadouli et Agnès Ribes.

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• d’actualités commentées offrant une vision critique d’une sélection d’articles internationaux et leur mise en perspective en pratique clinique.
Vous trouverez ci-après une sélection de ces articles récents, décryptés, analysés et commentés pour vous par Victor-Emmanuel Brett, Alexandre Butelet, Selma Kadouli et Agnès Ribes.

 

INTERFÉRENCES ASSOCIÉES AUX INHIBITEURS DU FACTEUR XIA, L’ASUNDEXIAN ET LE MILVEXIAN, DANS LES TESTS D’HÉMOSTASE DE ROUTINE ET SPÉCIALISÉS, ET LEUR RÉVERSION PAR ADSORPTION SUR CHARBON ACTIVÉ
D’après : Interferences associated with the factor XIa inhibitors asundexian and milvexian in routine and specialized coagulation assays and their removal by activated charcoal-based adsorbents. Buckley GT, Crowley MP, Harte JV. J Thromb Haemost 2025 ; 23 : 2819-29.
Actualité commentée réalisée par Victor-Emmanuel BRETT

Justificatifs et objectifs
L’inhibition du facteur XI/XIa (FXI/FXIa) est une nouvelle stratégie d’anticoagulation prometteuse pour la prévention du risque thromboembolique, tout en réduisant le risque hémorragique associé à l’utilisation des anticoagulants oraux directs (AOD) anti-IIa ou Xa actuels. Toutefois, comme ces derniers, ces nouvelles molécules peuvent interférer avec les tests d’hémostase. Cette étude vise à évaluer, à doses thérapeutiques et suprathérapeutiques, l’impact de deux inhibiteurs oraux du FXIa (asundexian, milvexian) sur un large panel de tests de coagulation et à déterminer si l’adsorption par charbon activé (charbon actif, DOAC-Stop) permet de s’en affranchir.

Méthodes
Du plasma commercial standard et du plasma pauvre en plaquettes prélevé chez 25 individus sains ont été additionnés in vitro d’asundexian ou de milvexian afin de reproduire des concentrations thérapeutiques (1 000-4 000 ng/mL) (1,2) et suprathérapeutiques (10 000 ng/mL). Les examens d’hémostase usuels (TP, TCA, fibrinogène, mesure des facteurs) et spécialisés (lupus anticoagulant, protéines C et S, résistance à la protéine C activée – Test ProC Global, facteur Willebrand) ont été mesurés sur des analyseurs Sysmex (CN-6000, CS-2500) pour apprécier l’impact des anti-XI. Les échantillons ont ensuite été traités par du charbon actif brut ou DOAC-Stop, afin d’apprécier la réversion de l’anticoagulant sur ces tests d’hémostase.

Résultats
Les inhibiteurs du FXIa n’ont montré aucune interférence avec les tests explorant la voie extrinsèque (TP, facteurs II, V, VII, X), avec la mesure du fibrinogène (Clauss), les tests chromogéniques ou immunologiques (antithrombine, protéine C/S, facteur Willebrand). En revanche, ils constituent une interférence analytique importante pour les facteurs de la voie endogène, de façon dose-dépendante : le TCA est significativement allongé (+159-257 %) et les activités coagulantes des facteurs VIII, IX, XI et XII sont sous-estimées (Tableau 1). Le test de résistance à la protéine C activée reste interprétable à 1 000 ng/mL, mais devient ininterprétable à 4 000 ng/mL.
L’adsorption des anti-FXI/FXIa par le charbon corrige complètement ces interférences, en rétablissant les valeurs du TCA et des facteurs de la voie endogène à leurs valeurs attendues pour toutes les concentrations testées.

 

Tableau 1 : Impact des inhibiteurs du FXIa sur les tests de coagulation.
Table 1: Effect of FXIa inhibitors on coagulation tests.

Avis d’expert
Cette étude apporte des données sur les interférences analytiques sur les tests d’hémostase des nouveaux anticoagulants ciblant le facteur XIa (asundexian et milvexian). Si les premiers résultats des études cliniques concernant leur efficacité sont variables (décevants pour OCEANIC-AF et LIBREXIA, encourageants pour OCEANIC-STROKE), les laboratoires de biologie médicale doivent impérativement anticiper l’impact analytique de ces médicaments. Les résultats sont cohérents avec leurs propriétés pharmacologiques : en inhibant directement le FXIa, ces molécules perturbent spécifiquement et massivement les tests dépendants de la voie intrinsèque de la coagulation. Cela génère un allongement dose-dépendant du TCA et des déficits d’activité marqués pour les facteurs VIII, IX, XI et XII. Comme attendu, la réduction d’activité la plus drastique concerne logiquement le facteur XI. L’analyse comparative révèle par ailleurs que le milvexian exerce des interférences légèrement plus prononcées que l’asundexian sur ces paramètres. Il est à noter que l’impact des dilutions sérielles lors de la mesure des facteurs de la voie endogène, qui limiterait théoriquement l’effet de l’anti-XI sur l’activité mesurée, n’est pas abordé dans cette étude. L’étude valide aussi l’absence d’impact sur la mesure du TP, des facteurs de la voie exogène et du fibrinogène, mais également sur des tests spécialisés : activité du facteur Willebrand, bilan de thrombophilie constitutionnelle (activités anticoagulantes de l’antithrombine, de la protéine C et de la protéine S libre) ou acquise (recherche de lupus anticoagulant utilisant le dRVVT).
Enfin, ce travail valide l’utilisation du charbon actif pour adsorber ces médicaments, neutraliser l’interférence analytique des anti-XIa et corriger les temps de coagulation. Cependant, une réserve s’impose : en l’absence de tests de mesure spécifiques et calibrés pour ces deux médicaments et de seuil défini de pertinence clinique pour ces molécules, il est impossible d’exclure formellement la persistance d’interférences résiduelles dans tous les cas.
De plus, il convient de souligner les limites inhérentes au design in vitro de cette étude : l’utilisation de plasmas de donneurs sains chargés en médicaments ne reproduit pas parfaitement la complexité physiologique des échantillons prélevés chez des patients traités in vivo, notamment en l’absence de métabolisme des médicaments.
Les résultats obtenus après adsorption devraient être accompagnés d’un commentaire précisant la méthode utilisée, afin de garantir une décision clinique sûre, notamment en cas d’urgence. En conclusion, bien que ces résultats prometteurs nécessitent une validation ex vivo sur des échantillons de patients issus de cohortes réelles, ils offrent dès à présent un cadre analytique informatif pour les laboratoires.

Références
1. Kubitza D, Heckmann M, Distler J, Koechel A, Schwers S, Kanefendt F. Pharmacokinetics, pharmacodynamics and safety of BAY 2433334, a novel activated factor XI inhibitor, in healthy volunteers: A randomized phase 1 multiple-dose study. Br J Clin Pharmacol 2022 ; 88 : 3447‑62.
2. Perera V, Abelian G, Li D, Wang Z, Zhang L, Lubin S, et al. Single-Dose Pharmacokinetics of Milvexian in Participants with Mild or Moderate Hepatic Impairment Compared with Healthy Participants. Clin Pharmacokinet 2022 ; 61 : 857‑67.

 

CLASSIFICATION FONCTIONNELLE DE VARIANTS GÉNÉTIQUES PLAQUETTAIRES PAR L’UTILISATION DE CRISPR HDR DANS DES CELLULES CD34+ DIFFÉRENCIÉES EN MÉGACARYOCYTES
D’après : Functional classification of platelet gene variants using CRISPR HDR in CD34+ cell-derived megakaryocytes. Kosaka Y, Lopez B, Kishimoto N, Jacob S, Montenont E, Huallanca R, et al. Am J Hum Genet 2025 ; 112 : 2888-901.
Actualité commentée réalisée par Alexandre BUTELET

Justificatifs et objectifs
L’interprétation des variants génétiques à l’origine des pathologies plaquettaires constitutionnelles (PPC) est un défi clinique majeur puisque la plupart de ceux-ci sont classés en variants de signification indéterminée (VSI). La fiabilité d’un modèle cellulaire spécifique plaquettaire pour l’étude fonctionnelle de ces VSI est une étape clé. Les auteurs de cette étude ont développé un système d’édition génique, via une réparation de l’ADN par recombinaison homologue, basé sur la technique CRISPR-Cas9 dans des cellules CD34+ différenciées en mégacaryocytes (MK) leur permettant le reclassement de 3 VSI par une étude fonctionnelle globale dans la thrombasthénie de Glanzmann (TG).

Méthodes
Les auteurs ont modifié une technique basée sur l’édition génique, via le complexe ribonucléoprotéique CRISPR-Cas9, optimisée pour l’étude des PPC, dans des MK issus de cellules CD34+ de donneurs volontaires sains ou de sang de cordon ombilical humain. Les cellules CD34+ étaient mises en culture et transfectées par le complexe CRISPR-Cas9 pour diriger une modification de l’ADN par recombinaison homologue avec différentes séquences simple brin (ADNsb). Les ADNsb étaient des séquences connues bénignes, malignes ou des VSI pour les gènes ITGA2B et ITGB3. Une étude fonctionnelle a ensuite été réalisée sur les MK de ces cellules CD34+ modifiées (Figure 1).

Figure 1 : Principe de l’utilisation d1u0 s0ystème CRISPR Cas9 HDR appliqué à l’étude des m4égacaryocytes dérivés de cellules hématopoïétiques humaines CD34+ dans la thrombasthénie de Glanzmann.
Figure 1: Principle of the CRISPR-Cas9 HDR system applied to the study of megakaryocytes derived from human CD34+ hematopoietic cells in Glanzmann’s thrombasthenia.
Pour générer des mégacaryocytes (MK) modifiés par CRISPR avec des variants correctement intégrés, les cellules CD34+ sont cultivées avec du facteur de croissance de cellules souches et de la thrombopoïétine pour initier les cultures de MK (J0 à J6). Les cellules cultivées sont isolées et transfectées entre les J3 et J5 avec le complexe guide ARN CRISPR/ARN CRISPR transactivateur, la protéine Cas9 et un ADN simple brin pour la recombinaison homologue avec le variant cible souhaité ou une séquence silencieuse. Les cellules modifiées sont différenciées en MK fonctionnels avec la TPO de J6 à J13 jusqu’à ce que 70 à 90 % des cellules expriment les marqueurs de maturation des MK (i.e. αIIb [CD41]+/GPIX [CD42a]+).

Résultats
Les auteurs ont modifié et différencié en MK au moins 90 % de cellules CD34+ avec leur technique CRIMSON HD (CRISPR-edited megakaryocytes [MKs] for surveying platelet variant functions through homology-directed repair [HDR]). La validation de cette technique reposait sur l’étude d’un variant ITGA2B (p.Phe191_Ser192insArgThr) déjà caractérisé responsable d’une TG de type III avec notamment une vérification de l’intégration par méthode Sanger. L’étude de la reproductibilité de cette méthode évaluait la fixation de l’anticorps PAC-1 et du fibrinogène soluble à l’intégrine αIIbβ3, ainsi que l’expression de P-sélectine après stimulation par la convulxine. L’insertion du variant p.Phe191_Ser192insArgThr permettait une expression de surface normale de l’intégrine αIIbβ3 à des niveaux comparables à ceux observés dans les témoins non édités.
Cependant, malgré une expression de surface conservée de l’intégrine αIIbβ3, les MK stimulés par la convulxine et porteurs du variant p.Phe191_Ser192insArgThr présentaient une perte complète de la liaison au PAC-1, tandis que la translocation de la P-sélectine restait intacte dans tous les groupes, confirmant que l’insertion p.Phe191_Ser192insArgThr affecte spécifiquement l’activation de l’intégrine αIIbβ3. Pour évaluer l’utilité de la technique CRIMSON HD dans la classification fonctionnelle des variants, les auteurs ont étudié un variant probablement pathogène du gène ITGA2B, c.601G>A (p.Gly201Ser [G201S]), ainsi que deux VSI voisins issus de la banque de données ClinVar : ITGA2B c.602G>C (p.Gly201Ala [G201A]) et c.599C>T (p.Ala200Val [A200V]).
L’étude fonctionnelle des variants p.Gly201Ser et p.Ala200Val du gène ITG2AB a permis de les classer en variants probablement pathogènes. Celle du gène ITGB3 a reclassé le variant p.Arg119Gln en pathogène (Tableau 1). Ce dernier variant serait responsable de la perte de l’épitope plaquettaire HPA-1a associé à une thrombopénie fœtale et néonatale allo-immune, les résultats orientent plutôt vers une diminution de la liaison par anticorps à HPA-1a via une expression défectueuse de l’intégrine αIIbβ3.

 

Tableau 1 : Impact du système CRIMSON HD sur le reclassement de variants de signification indéterminée des gènes ITGA2B et ITGB3.
Table 1: Impact of the CRIMSON HD system on the reclassification of variants of uncertain significance in the ITGA2B and ITGB3 genes.

Avis d’expert
L’interprétation des variants génétiques dans les PPC est un défi clinique majeur en raison de la prévalence de ces pathologies estimée entre 1/106 et 1/104 par rapport à la population générale. La preuve biologique de l’impact de ces variants sur les fonctions plaquettaires est difficile à obtenir. À ce jour, 72 gènes ont été identifiés comme étant à l’origine de PPC. Cependant, 98 % des variants identifiés de manière générale sont classés en VSI selon la classification ACMG (1), ce qui implique des décisions thérapeutiques basées sur des hypothèses. On dénombre 800 variants impliqués dans les PPC, dont 657 portant sur les gènes ITGA2B et ITGB3 codant pour l’intégrine αIIbβ3. Les auteurs de cette étude sont parvenus à modifier une technique d’édition génique permettant une intégration et un remplacement fiable de séquences à étudier (2).
La difficulté de l’étude des VSI en PPC repose sur l’interprétation des résultats issus des lignées cellulaires. L’étude de cellules CD34+ humaines différenciées en MK semble s’approcher d’un modèle cellulaire plus fiable sans toutefois permettre l’étude du microenvironnement hématopoïétique. Une alternative à l’utilisation de cellules CD34+ pourrait être la différenciation dirigée de cellules souches pluripotentes induites en MK, puis en plaquettes. Les plaquettes étant dépourvues de noyau, l’édition génique appliquée aux MK semble un compromis pertinent et acceptable pour l’étude des fonctions plaquettaires sans toutefois permettre pour le moment l’étude fiable des signaux inside-out de l’intégrine αIIbβ3.
Bien qu’intéressants, ces résultats appliqués à la TG devront être confirmés et étudiés pour les autres PPC.
La technologie CRIMSON HD ouvre un champ d’application à d’autres pathologies constitutionnelles, la réponse cellulaire aux traitements médicamenteux, l’étude de la signalisation intracellulaire ou la génération de plaquettes.

Références
1. Richards S, Aziz N, Bale S, Bick D, Das S, Gastier-Foster J, et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genet Med 2015 ; 17 : 405-24.
2. Riesenberg S, Kanis P, Macak D, Wollny D, Düsterhöft D, Kowalewski J, et al. Efficient high-precision homology-directed repair-dependent genome editing by HDRobust. Nat Methods 2023 ; 20 : 1388-99.

 

MODIFICATION DU FACTEUR VIII DE LA COAGULATION AFIN D’AMÉLIORER SA SÉCRÉTION ET SON ACTIVITÉ COAGULANTE EN VUE D’UNE UTILISATION EN THÉRAPIE GÉNIQUE DE L’HÉMOPHILIE A
D’après : Engineered coagulation factor VIII with enhanced secretion and coagulation potential for hemophilia A gene therapy. Kashiwakura Y, Nakajima Y, Horinaka K, Lopes TJS, Furuta Y, Yamaguchi Y, et al. Blood 2026 ; 147 : 402-15.
Actualité commentée réalisée par Selma KADOULI

Justificatifs et objectifs
L’hémophilie A est une maladie hémorragique qui résulte d’un déficit constitutionnel en facteur VIII (FVIII). Afin de pallier les traitements substitutifs par voie intraveineuse, qui nécessitent des injections en facteur VIII répétées et contraignantes, de nouveaux traitements sont nécessaires.
La thérapie génique basée sur l’utilisation de virus adéno- associés (AAV) permet une expression prolongée de facteur VIII et constitue donc une alternative thérapeutique prometteuse. Cependant, des améliorations permettant l’administration de doses d’AAV plus basses et un maintien à long terme d’un taux de facteur VIII satisfaisant sont nécessaires. Une des limites actuelles est la faible sécrétion de FVIII du fait d’un repliement inefficace de la protéine durant sa synthèse, imposant l’utilisation de doses élevées d’AAV.
L’objectif de cette étude est de développer un FVIII optimisé, avec une meilleure sécrétion et un potentiel coagulant augmenté, afin de réduire la dose d’AAV injectée et ainsi optimiser les stratégies de thérapie génique.

Méthodes
Les auteurs ont conçu des variants du facteur VIII humain déplété du domaine B (FVIIISQ), en s’inspirant de séquences de FVIII d’autres espèces afin d’améliorer la sécrétion de celui-ci et réduire la taille du gène à incorporer au sein de l’AAV.
Les variants ont été exprimés in vitro au sein de cellules hépatiques humaines (Huh-7) afin d’évaluer la sécrétion et l’accumulation intracellulaire de FVIII ainsi que le stress du réticulum endoplasmique (via la mesure de la réponse aux protéines mal repliées). Les variants les plus prometteurs ont ensuite été testés in vivo, via l’utilisation de vecteurs AAV dans des modèles murins de souris avec HA ainsi que chez des macaques cynomolgus, afin de mesurer les concentrations plasmatiques de FVIII et son activité coagulante.

Résultats
Le FVIIISQ, modifié par ingénierie, présente une activité coagulante significativement augmentée (d’environ 3,6 fois) par rapport au FVIII standard chez des souris hémophiles A.
In vitro, les auteurs ont montré que la présence du FVIIISQ permettait une sécrétion accrue de FVIII, une réduction de la rétention intracellulaire, ainsi qu’une diminution des marqueurs de stress du réticulum endoplasmique. Les analyses fonctionnelles indiquent une interaction renforcée avec le facteur IXa, améliorant ainsi l’efficacité du complexe ténase. In vivo, chez la souris et le macaque, cette construction permet d’atteindre des niveaux plasmatiques élevés de FVIII avec des doses de vecteur AAV fortement réduites.
Aucun effet secondaire (en termes de toxicité hépatique ou d’événement thrombotique) n’a été observé. Toutefois, il est à noter qu’une réponse immunitaire anti-FVIII a été détectée chez certains animaux.

Avis d’expert
Cette étude propose une approche particulièrement pertinente pour surmonter les limites actuelles de la thérapie génique dans l’hémophilie A. L’ingénierie du facteur VIII permet ici de cibler un verrou biologique majeur : la faible efficacité de production du FVIII et la toxicité cellulaire associée.
Les résultats montrent un gain fonctionnel notable, associé à une meilleure sécrétion et à une diminution du stress du réticulum endoplasmique, ce qui constitue un progrès important. L’intérêt principal réside dans la possibilité d’obtenir des concentrations plus élevées avec des doses d’AAV significativement réduites. Cela pourrait améliorer le profil de sécurité des vecteurs AAV, notamment en limitant la toxicité hépatique et les réponses immunes liées à la dose d’AAV. Ce point est crucial dans un contexte où les événements indésirables et la variabilité d’expression restent des freins à la diffusion large de ces thérapies.
Néanmoins, plusieurs limites sont à souligner. Les données restent précliniques, et la transposition à l’homme des résultats observés reste à mettre en œuvre, en particulier concernant la durabilité de l’expression du FVIII et le risque immunogène. L’apparition d’anticorps anti-FVIII observée dans cette étude met en exergue le fait que l’immuno-génicité reste un enjeu central de la thérapie génique au cours de l’hémophilie A.
En conclusion, les données présentées sont encourageantes et permettent de voir que des améliorations du FVIII sont possibles dans le cadre de la thérapie génique de l’hémophilie A. L’utilisation d’un facteur VIII modifié, permettant une meilleure sécrétion et une diminution du stress du réticulum endoplasmique, constitue une avancée notable vers l’obtention de taux de facteur VIII plus stables au cours du temps, associés à une diminution de la dose d’AAV à injecter au patient.

 

LE THIAZOLE ORANGE : UN OUTIL COMPLÉMENTAIRE AUX MÉTHODES DIAGNOSTIQUES ÉTABLIES DES ANOMALIES HÉRÉDITAIRES DES GRANULES DENSES
D’après : Thiazole orange: a complement to established methods for diagnosing inherited dense granule defects. Martin M, Strandberg K, Zetterberg E, Norström E. Platelets 2025 ; 36 : 2592683.
Actualité commentée réalisée par Agnès RIBES

Justificatifs et objectifs
Les déficits constitutionnels en granules denses (anomalie de contenu et/ou de sécrétion) plaquettaires sont probablement sous-diagnostiqués en raison des limites des outils diagnostiques actuels. En effet, si les formes sévères, notamment syndromiques, comme le syndrome de Hermansky-Pudlak ou de Chediak-Higashi, sont facilement identifiables, les formes plus modérées manquent d’outils accessibles et sensibles. De plus, les techniques de référence basées sur la microscopie électronique ou la sérotonine radiomarquée restent peu accessibles, même pour des laboratoires spécialisés. Enfin, l’analyse moléculaire n’est jamais réalisée en première intention et, là encore, des formes sans thrombopénie peuvent être manquées.
Dans ce contexte, un fluorochrome cationique, la mépacrine, quantifiable par cytométrie en flux, avait été développé dans les années 1990. Toutefois, les études rapportent une faible valeur prédictive positive (environ 35 %).
L’objectif de cette étude est d’examiner la pertinence du thiazole orange (TO), un agent intercalant fluorescent des acides nucléiques habituellement utilisé pour quantifier les réticulocytes et les plaquettes réticulées, comme nouveau marqueur des granules denses en cytométrie de flux. Ainsi, les auteurs ont testé le TO pour distinguer les déficits quantitatifs des déficits de sécrétion des granules denses et l’ont comparé à la mépacrine.

Méthodes
L’étude a porté sur 12 volontaires sains et 15 patients suspectés de thrombopathie. Les méthodes employées comprenaient :
• Titration des colorants : comparaison du TO (via le réactif Retic-Count™) et de la mépacrine sur des plaquettes au repos et activées par le TRAP-6 (80 µM) à température ambiante et à 37 °C ;
• Analyse par cytométrie de flux : mesure de l’intensité de fluorescence (GeoMean) sur un cytomètre Navios ;
• Les résultats du TO ont été comparés à l’agrégométrie optique (LTA) et à l’expression de marqueurs d’activation (CD62P, CD63, PAC-1).

Résultats
Concernant les capacités de détection de la sécrétion des granules denses, correspondant à la variation de fluorescence entre un état au repos et un état activé, en réponse au TRAP-6 (80 µM à 37 °C pendant 15 min), les auteurs montrent que le TO (non dilué) est supérieur à la mépacrine (104 µM) (différence de fluorescence à 75 % pour le TO contre 20-30 % pour la mépacrine).
Concernant la sensibilité de détection d’une anomalie de sécrétion des granules denses, les auteurs montrent que seul le TO permet de suivre une diminution dose-dépendante de la fluorescence (test de titration de la fluorescence émise en réponse à des concentrations croissantes de TRAP-6, 0 à 80 µM).
Les auteurs ont ensuite réalisé une étude pilote sur 15 échantillons de patients suspects d’une thrombopathie et comparé le résultat obtenu avec le TO versus les réponses obtenues en agrégométrie (ADP 2 µM, collagène 2 µg/mL, épinéphrine 5 µM, ristocétine 1,2 mg/mL) et en cytométrie en flux (CD62P, CD63, PAC-1). Leurs résultats suggèrent que le TO pourrait permettre de distinguer un déficit en granules denses d’un défaut de dégranulation.

Avis d’expert
Les auteurs présentent le TO comme un outil diagnostique prometteur et un complément précieux pour le dépistage des anomalies héréditaires des granules denses. Ils avancent plusieurs avantages concrets par rapport à la mépacrine, principalement en raison des propriétés fluorescentes et de la sensibilité accrue du TO.
Ils exploitent les données publiées par Robinson et ses collaborateurs en 1998 (1) selon lesquelles, à forte concentration, le TO se fixerait ailleurs que sur les acides nucléiques/nucléotides et pourrait s’accumuler dans les granules denses où il interagirait avec l’ADP/ATP intra- granulaire.
Ils précisent que, d’un point de vue biochimique, le TO présenterait un meilleur rapport signal/bruit ; constitué de cyanines, le TO est une molécule très peu fluorescente en solution libre, mais sa fluorescence est multipliée par 1 000 lorsqu’il se lie à sa cible (acides nucléiques et nucléotides).
À l’inverse, la mépacrine est déjà très fluorescente lorsqu’elle n’est pas liée, ce qui génère davantage de bruit de fond défavorable et réduit la précision du test.
Les auteurs démontrent que le TO a une grande amplitude de signal à 37 °C où la différence de fluorescence entre plaquettes au repos et plaquettes activées atteint 70 %. En comparaison, la mépacrine ne montre qu’une amplitude de 20-30 %.
Les auteurs discutent également de la facilité d’analyse du TO en raison d’un spectre d’émission plus étroit que pour la mépacrine, ce qui facilite sa détection (pas/peu de chevauchement) et permet de l’associer à d’autres marqueurs d’activation de la sécrétion plaquettaire (CD62P, CD63) dans un seul et même test.
Enfin, les auteurs suggèrent que le TO présenterait une sensibilité accrue pour les formes modérées d’anomalies granulaires. Compte tenu de sa grande amplitude de signal, le TO pourrait être plus sensible pour détecter des défauts partiels en granules denses (quantitatif, de contenu, ou d’exocytose) chez des patients pour lesquels les résultats aux tests standards (agrégométrie ou CD63) apparaissent normaux.
Ainsi, là où la mépacrine est limitée par une faible valeur prédictive positive (35 %), le TO serait plus sensible pour dépister, voire caractériser, un défaut en granules denses.
Des limites doivent toutefois être soulignées, et la première concerne le signal interprété comme spécifique par les auteurs ; pour ces derniers, il ne peut correspondre qu’au marquage exclusif des granules denses.
Or, le TO est un cation lipophile pouvant s’accumuler dans des lysosomes, ou tout autre compartiment, dont le pH est maintenu acide par un gradient de protons, indépendamment du contenu en nucléotides. De fait, toute anomalie de pompes à protons et/ou du trafic lysosomal peut modifier le signal, indépendamment du contenu granulaire, et générer un signal faussement positif.
Par ailleurs, les travaux de Robinson et al. ne sont illustrés par aucune donnée d’imagerie confocale.
De même, le taux de plaquettes réticulées peut interférer (thrombopénie périphérique, thrombopénie immunologique, turn-over augmenté) et venir surestimer le TO incorporé, d’autant que la concentration utilisée ne discrimine pas le marquage granulaire du marquage ribonucléique. Les conditions analytiques sont spécifiées pour 37 °C afin d’avoir la meilleure amplitude de signal ; toutefois, rien n’est spécifié concernant les délais préanalytiques, les conditions de réalisation des tests (pH, concentration en Ca2+, fixation du plasma riche en plaquettes) ou la nécessité d’une calibration interne.
De plus, le gain de 70 % en TO versus 30 % en mépacrine entre plaquettes au repos et activées reste un gain analytique qui ne permet pas à lui seul d’établir une preuve de supériorité diagnostique. Il aurait fallu présenter une courbe ROC avec un tableau de concordance comportant sensibilité/spécificité et valeur prédictive négative/positive. Les auteurs parlent de supériorité du TO sur la mépacrine mais ne présentent aucune analyse de performance, ni aucune donnée statistique.
Enfin, la cohorte de patients est extrêmement modeste (n = 15), contre une population contrôle également trop faible (n = 12) pour définir un intervalle de référence, et non comparée à un gold standard (pas de microscopie électronique ni d’HPL pour le dosage de la sérotonine).
Concernant le marquage par la mépacrine, les plaquettes sont marquées après stimulation, ce qui n’est habituellement pas recommandé (test d’uptake et non de release).
La mépacrine étant un composé fluorescent cationique lipophile, il est très étonnant de voir si peu de différence entre les conditions de repos et après activation.
En conclusion, le TO peut effectivement être une méthode prometteuse, mais reste au stade exploratoire, et nécessite une validation plus robuste (cohorte indépendante corrélée à un gold standard) avant d’être utilisé en pratique courante.

Référence
1. Robinson MS, Mackie IJ, Khair K, Liesner R, Goodall AH, Savidge GF, et al. Flow cytometric analysis of reticulated platelets: evidence for a large proportion of non-specific labelling of dense granules by fluorescent dyes. Br J Haematol 1998 ; 100 : 351-7.