RÉSUMÉ
Plus de 2 000 variants délétères ont été décrits dans les bases de données comme causes d’hémophilie A. l’une des plus fréquentes maladies hémorragiques constitutionnelles. Cependant, l’anomalie moléculaire responsable reste non identifiée chez 2-5 % des patients tous phénotypes confondus, malgré une exploration extensive du gène F8 par toutes les techniques de biologie moléculaire disponibles en diagnostic de routine (recherche de l’inversion de l’intron 22 et de l’intron 1, séquençage de la région codante et des régions 5′ et 3 non traduites, recherche des grands réarrangements). Alors qu’ils n’étaient pas étudiés auparavant, il a été établi que des variants localisés profondément dans les introns peuvent aussi causer l’hémophilie A, par altération du mécanisme d’épissage. En effet, ils sont susceptibles de moduler, créer ou supprimer les sites accepteurs ou donneurs d’épissage, et ainsi provoquer « l’exonisation » de séquences introniques ou un épissage alternatif délétère avec saut d’exon. Pour les étudier, il est indispensable de pouvoir associer une méthode de séquençage (type « next-generation sequencing » pour étudier le gène F8 entier ou séquençage de Sanger pour étudier un intron en particulier), et des études fonctionnelles pour confirmer l’impact du variant ex vivo (étude de l’ARNm du patient) et in vitro (minigène). Ces approches représentent une charge de travail beaucoup plus importante, mais sont indispensables pour pouvoir identifier le variant pathogène responsable de l’hémophilie A dans ces familles.
MOTS CLÉS
ARNm, hémophilie A, introns, minigène, séquençage haut-débit
ABSTRACT
More than 2000 pathogenic variants have been described in databases as causing hemophilia A, one of the most common inherited bleeding disorder. However, the causative variant remains unidentified in 2-5% of hemophilia A patients despite an exhaustive exploration of the F8 gene using all molecular biology techniques available in routine diagnosis laboratories (inversion of intron 22 and intron 1, sequencing all F8 exons and 5' and 3' untranslated regions, analysis of copy number variants). Although there were not studied before, it has been established that deep intronic variants Can cause hemophilia A by altering the splicing process. They Can modulate. create or remove acceptor or donor splice sites, thus lead to the "exonisation" Of intronic sequences or to a pathogenic alternative splicing with exon skipping events. The study of these deep intronic variants must combine a sequencing methcd (next-generation sequencing for a complete F8 gene analysis or Sanger sequencing for analyzing an Intron in particular) and functlonal studies to confirm the pathogenic impact of the variant ex vivo ImRNA sequencingl or in vitro (minigene splicing reporter assay). Conducting these analyses involves a significantly heavier workload but is essential to identify the pathogenic variant responsible for hemophilia A in these families.
KEYWORDS
hemophilia A, high-throughput sequencing, introns, minigene, mRNA
